Microscopios electrónicos Hace unos 50 años los biólogos comenzaron a plantearse la necesidad de sustituir las imágenes obtenidas mediante luz visible por la suministrada por los electrones. De este modo, utilizando el poder de penetración de estos últimos y el contraste suministrado por metales pesados, el límite de resolución podía ser 100.000 veces más pequeño que el del ojo humano. En un microscopio electrónico (ME) que tiene un voltaje de aceleración de los electrones de 100.000 voltios, la longitud de onda de un electrón es de 0,004nm, de manera que en teoría, la resolución de un microscopio de este tipo sería de aproximadamente 0,002nm. Sin embargo debido a que las aberraciones de las lentes electrónicas son más difíciles de corregir que las de las de vidrio, la resolución de los microscopios electrónicos actuales es, en el mejor de los casos de 0,1nm (1Å). Es más, los problemas relacionados con la preparación de las muestras, el contraste y la radiación, limitan claramente la resolución obtenida a partir de muestras biológicas a unos 2nm (20Å) y sin 12 embargo esta resolución práctica es unas 100 a 300 veces más grande que la obtenida mediante un microscopio óptico (0,2µm).
Microscopio electrónico de transmisión El microscopio electrónico de transmisión (MET) es, en sus principios generales, similar a un microscopio óptico. La fuente de iluminación es un filamento o cátodo situado en la parte superior de una columna cilíndrica de unos 2 metros de altura. Del cátodo emergen los electrones. Debido a que los electrones pueden ser dispersados por las moléculas de aire, se debe trabajar en vacío. A continuación, los electrones son acelerados y migran hacia un ánodo que pueden atravesar mediante un pequeño orificio del mismo. De ese modo forman un haz que es dirigido a la parte inferior de la columna.
Unas bobinas electromagnéticas situadas a intervalos a lo largo de la columna enfocan el haz de electrones, de la misma manera que las lentes enfocan el haz lumínico en el microscopio óptico. La muestra es colocada dentro del tubo y en el camino del haz de electrones. Algunos de los electrones que pasan a través de la muestra son dispersados en función de la densidad local del material. El resto de los electrones son enfocados formando una imagen, de manera idéntica en que se forma la imagen en un microscopio óptico, y son visualizados mediante una placa fotográfica o una pantalla fluorescente. Debido a que los electrones dispersados no llegan a ser visualizados, las regiones densas aparecen más oscuras con respecto a las áreas menos densas. Para obtener una buena imagen, la muestra debe estar correctamente preparada.
Debido a que las muestras son atravesadas por un haz de electrones de alta intensidad, no es posible la observación de muestras de material vivo o húmedo. Normalmente los tejidos son protegidos mediante la fijación. Como los electrones tienen un poder de penetración limitado, generalmente los tejidos fijados son cortados mediante un ultramicrótomo en secciones extremadamente delgadas (de 50 a 100nm de grosor, esto es aproximadamente 1/200 del grosor de una célula) antes de poder ser observadas. Para lograr la deshidratación de la muestra se la infiltra con una resina monomérica que al polimerizar forma un sólido bloque de plástico. El bloque es luego cortado mediante un ultramicrótomo con una 13 cuchilla de vidrio o de diamante.
Las secciones ultrafinas, libres de agua y de otros solventes volátiles son recogidas sobre unas pequeñas rejillas metálicas circulares. Luego las muestras son teñidas mediante sales de metales pesados y pueden finalmente observarse al MET. Este modo de preparación de las muestras permite observarlas en dos dimensiones. Efectivamente, las secciones ultrafinas son cortes bidimensionales de un tejido y no revelan la disposición tridimensional de los componentes celulares. La tercera dimensión puede ser reconstruida a partir del estudio de centenares de cortes seriados, algo que implica un proceso largo y meticuloso. También es posible utilizar el MET para la observación de la disposición de las estructuras internas de las células. En ese caso, las muestras no se deben incluir ni cortar, sino que se deben congelar a -196ºC. Una vez congeladas se procede a la fragmentación que consiste en colocar una fracción de la muestra en una rejilla. Luego se procede a su teñido. Normalmente las células tienden a separar las dos capas lipídicas de las diferentes membranas celulares. A este procedimiento se lo conoce como criofractura.
Microscopio electrónico de barrido Para la obtención de imágenes tridimensionales existen diferentes sistemas. El sistema más comúnmente utilizado consiste en examinar las muestras en un microscopio electrónico de barrido (MEB). Mientras que en el MET las imágenes se forman a partir de los electrones que han atravesado la muestra, en el MEB se utilizan los electrones dispersados o emergentes de la superficie de la muestra. La muestra a examinar en el MEB, es fijada, desecada y recubierta por una fina capa de un material pesado. Seguidamente la muestra es barrida por un haz focalizado de electrones. Por consiguiente, esta técnica se utiliza para el estudio de superficies celulares o tejidos, 14 no para organelas.
Como hemos visto, existen varios métodos que nos permiten explorar una estructura y comprenderla en su totalidad. La fotomicrografía es la fase final de un protocolo experimental, previamente diseñado en función de una finalidad determinada. Es decir la fotomicrografía es una muestra parcial del objeto estudiado.
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